中玉金标记采用英国 LGC (Laboratory of theGovernment Chemist)有限公司 KASP 技术来进行SNP 检测服务，该技术具有标记转化成功率高、分型准确、开发费用低、灵活性强等特点，在国际上，已经广泛地应用到 SNP 检测中。中玉金标记 KASP 标记开发流程主要包括 SNP 及侧翼序列分析，KASP 标记设计、标记验证、样品检测等步骤（如图 1）。

用户可以从公司项目部或指定的位置获得客户序列提交表，按照表格的要求填写序列信息，包括 SNP 名称、作物名称、SNP 及侧翼序列、序列在检测作物基因组中的唯一性及提交样品序列的一致性等（见附表 1），提交的序列要求真是可靠。

客户如果要在客户样品中检测标记，需要提交 92 个样品用来标记验证，一般以 96 孔板的方式提交，剩余 4 个空点在标记验证中作为无样品阴性对照，若无足够的样品，最低不能少于 46个；

提交的样品要求在要验证的位点中具有多态的，major:minor<9:1，以满足标记分型的需要；提交样品中最好有已知分型的样品，以便辅助分型、增加标记准确性。

中玉金标记拥有高通量 DNA 提取平台，对于玉米、小麦、水稻等多种大田作物，已经有从叶片提取基因组 DNA 成熟方法，对于这些作物，客户可以直接送植物样品，中玉金标记负责植物DNA 提取。通过 OD 测定与电泳对标记验证用 DNA 进行质量控制后，经过均一化后的 DNA 用于标记验证。样品提交见附表 2。

根据客户提供的序列信息进行分析，判断是否满足标记设计的要求，如果客户不能确定，全基因组测序已完成，可以由中玉金标生物信息部完成序列分析；

标记设计要求如下：

1. 客户提供的 SNP 侧翼序列在待检测样品的基因组中必须为唯一拷贝；

2. 客户提供的 SNP 侧翼序列与待检测样品的基因组序列最好完全匹配；

KASP 是竞争性等位基因特异 PCR（Kompetitive Allele Specific PCR ）缩写，该技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对 SNP 分型以及检测 InDels（其原理见图２）， 标记开发只需设计出一条通用和两条特异性的引物，引物为普通引物，不需要荧光标记。 中玉金标记可根据客户的要求，提供专业化的标记设计。

中玉金标记有中通量 LGC SNP line 和高通量 Douglas SNP 检测平台，可根据客户样品和标记数量来选择平台，对设计成功的标记在相应的平台上进行验证。

验证数据产生后，根据 SNP 分型、标记多态性、分型成功率、NTC 有无扩增以及对照样品分型结果等对标记进行评估，如图 3，在相应的平台上，分型明确、成功率高、NTC 无明显扩增、对照准确为验证成功的标记。

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